HPLC en massaspectrometrie, uitgelegd
Wat het zuiverheidspercentage echt meet, wat massaspectrometrie toevoegt, en de beperkingen van beide.
HPLC: scheiden en meten
Hoge-druk vloeistofchromatografie (HPLC) scheidt de componenten van een monster. Een detector, meestal UV rond 214–220 nm voor peptiden, tekent een chromatogram: elke piek is een component. Zuiverheid is het oppervlakte van de hoofdpiek gedeeld door het totale oppervlakte van alle pieken.
Massaspectrometrie: identiteit bevestigen
Massaspectrometrie (MS) meet de massa van de moleculen. Als de gemeten massa overeenkomt met de theoretische massa van de verwachte sequentie, wordt de identiteit van de verbinding bevestigd. HPLC alleen kan niet aangeven welk molecuul de hoofdpiek is.
Wat zuiverheid je niet vertelt
Een HPLC-zuiverheid van 99 % betekent niet dat het poeder 99 % peptide is. Gelyofiliseerde peptiden bevatten ook water en tegenionen (zoals acetaat of trifluoracetaat). De hoeveelheid werkelijke peptide wordt het netto-peptidegehalte genoemd en wordt afzonderlijk gemeten.